Ein maladaptiver Rückkopplungsmechanismus zwischen der extrazellulären Matrix und dem Zytoskelett trägt zur Pathophysiologie der hypertrophen Kardiomyopathie bei

Communications Biology Band 6, Artikelnummer: 4 (2023) Diesen Artikel zitieren

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Hypertrophe Kardiomyopathie ist eine Erbkrankheit aufgrund von Mutationen in kontraktilen Proteinen, die zu einem steifen, hyperkontraktilen Myokard führt. Um die Rolle der Herzsteifheit beim Fortschreiten der Krankheit zu verstehen, erstellen wir hier ein In-vitro-Modell der hypertrophen Kardiomyopathie unter Verwendung der Hydrogel-Technologie. Die Kultivierung von Wildtyp-Herzmuskelzellen auf Hydrogelen mit einem Young-Modul (Steifheit), die das Myokard einer hypertrophen Kardiomyopathie nachahmen, reicht aus, um einen hypermetabolischen mitochondrialen Zustand zu induzieren, im Vergleich zu Myozyten, die auf Hydrogelen plattiert sind und ein gesundes Myokard simulieren. Bezeichnenderweise spiegeln diese Daten die von Myozyten wider, die aus einem Mausmodell der humanen hypertrophen Kardiomyopathie (cTnI-G203S) isoliert wurden. Umgekehrt wird die Mitochondrienfunktion der cTnI-G203S-Myozyten vollständig wiederhergestellt, wenn sie auf Hydrogelen aufgetragen wird, die ein gesundes Myokard nachahmen. Wir identifizieren einen mechanosensierenden Rückkopplungsmechanismus zwischen der extrazellulären Matrix und dem Zytoskelettnetzwerk, der die Mitochondrienfunktion unter gesunden Bedingungen reguliert, aber am Fortschreiten der Pathophysiologie der hypertrophen Kardiomyopathie infolge sarkomerischer Genmutationen beteiligt ist. Wichtig ist, dass wir wichtige „Linker“-Stellen in diesem Schema identifizieren, die potenzielle therapeutische Ziele darstellen könnten.

Die hypertrophe Kardiomyopathie (HCM) ist eine autosomal-dominant vererbte Herzerkrankung, von der 1:500 der Allgemeinbevölkerung betroffen ist1. Es ist die häufigste Ursache für plötzlichen Herztod bei jungen Menschen (5–15 Jahre)2. HCM tritt hauptsächlich aufgrund genetischer Mutationen in sarkomeren Proteinen auf3,4. Zu den klinischen Merkmalen der HCM gehören eine linksventrikuläre Hypertrophie ohne erhöhte hämodynamische Belastung und ein nicht erweiterter linker Ventrikel mit erhaltener oder erhöhter Ejektionsfraktion1,4. Auf zellulärer Ebene ist HCM durch Umbau der Herzmuskelzellen, Desorganisation sarkomerer Proteine, interstitielle Fibrose und veränderten Energiestoffwechsel gekennzeichnet5. Wir haben zuvor eine Rolle des kardialen L-Typ-Kalziumkanals (LTCC) bei der Entwicklung der HCM-Pathophysiologie identifiziert6,7.

Der kardiale LTCC löst eine „Kalzium-induzierte Kalziumfreisetzung“ aus, die für die Aufrechterhaltung der Herzerregungs-Kontraktions-Kopplung von entscheidender Bedeutung ist8. Der kardiale LTCC spielt auch eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Mitochondrienfunktion über sowohl kalziumabhängige als auch kalziumunabhängige Mechanismen9,10. Insbesondere führt die Aktivierung des LTCC zu einem Anstieg des mitochondrialen Membranpotentials (Ψm), unabhängig davon, ob Kalzium vorhanden ist oder nicht9. Dies wird durch eine strukturell-funktionale Verbindung zwischen Kanal und Mitochondrien erleichtert. Das kardiale LTCC ist ein Transmembran-durchdringendes Protein, das aus den Untereinheiten α1C, α2δ und β2 besteht. Die β2-Untereinheit ist über die α-Interaktionsdomäne (AID)11 an die porenbildende α1C-Untereinheit gebunden. Die β2-Untereinheit assoziiert auch mit dem Neuroblasten-Differenzierungs-assoziierten Protein AHNAK, auch bekannt als Desmoyokin, einem großen subsarkolemmalen Protein, das ebenfalls an F-Actin12 verankert ist. Zytoskelettproteine, einschließlich F-Actin, interagieren direkt mit Mitochondrien, indem sie an äußere mitochondriale Dockingproteine binden13,14,15. Diese strukturelle Verbindung zwischen dem LTCC und den Mitochondrien spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Mitochondrienfunktion unter physiologischen Bedingungen, wobei Konformationsänderungen, die von Schlag zu Schlag in der LTCC-β2-Untereinheit auftreten, zu nachgelagerten Veränderungen der Mitochondrienfunktion führen9.

Beeinträchtigungen dieses intrazellulären Netzwerks sind mit einer Fehlregulation der Mitochondrienfunktion und der Entwicklung pathologischer Zustände verbunden6,7,16,17. Wir haben zuvor gezeigt, dass ein Mausmodell von menschlichem HCM, das die Troponin I (cTnI)-Genmutation Gly203Ser (cTnI-G203S) verursacht, eine gestörte Zytoskelettarchitektur, eine beeinträchtigte strukturell-funktionale Kommunikation zwischen dem LTCC und den Mitochondrien und einen daraus resultierenden hypermetabolischen mitochondrialen Zustand aufweist6,17 . Ähnliche Ergebnisse wurden bei Mäusen beobachtet, die die menschliche Krankheit tragen, die die Mutation der β-Myosin-Schwerkette Arg403Gln7 verursacht. Bemerkenswert ist, dass diese Reaktionen der Entwicklung des hypertrophen Zustands vorausgingen.

Der etablierte menschliche HCM-Phänotyp ist durch ein steifes Myokard gekennzeichnet18,19. Dementsprechend wurde eine erhöhte Proteinsynthese der extrazellulären Matrix (ECM) mit dem Fortschreiten der menschlichen HCM-Pathologie in Verbindung gebracht20,21,22. Tatsächlich weisen künstlich hergestellte Herzgewebe, die durch die Aussaat gesunder, vom Menschen induzierter pluripotenter Herzmuskelzellen aus Stammzellen auf Streifen dezellularisierten Myokards, die aus einem Schweinemodell von HCM gewonnen wurden, erzeugt wurden, eine erhöhte Steifheit auf21. Die ECM interagiert mit Herzmuskelzellen über das transmembranöse Mechanosensing-Protein Integrin, das auch an der Entwicklung einer Herzhypertrophie beteiligt ist23,24. Das zytosolische Protein Vinculin vermittelt die Bindung von Integrin an F-Aktin und überträgt mechanische Kräfte von der Zellmembran auf das Zytoskelett23,25,26. Daher scheint neben einem intrazellulären Netzwerk zwischen LTCC und Mitochondrien auch eine strukturell-funktionale Assoziation zwischen ECM und F-Aktin zu bestehen. Hier untersuchen wir die Rolle dieser Verbindung bei der Entwicklung der HCM-Pathophysiologie unter Einbeziehung des LTCC und der Mitochondrien, indem wir eine In-vitro-Plattform schaffen, die die HCM-Myokardsteifheit nachahmt.

Wir wollten ein In-vitro-Modell der hypertrophen Kardiomyopathie entwickeln. Wir begannen mit der Beurteilung der kompressiven Young-Moduli (Steifheit) von Hydrogelen, die hergestellt wurden, um gesundes („weiches“) und HCM („steifes“) Myokard nachzuahmen. Mittels Rasterkraftmikroskopie wurde die Gesamtdrucksteifigkeit von Hydrogelen bei 12,5 ± 0,4 bzw. 34,1 ± 0,9 kPa aufgezeichnet (p < 0,05, Abb. 1b). Anschließend verwendeten wir eine H9C2-Myoblastenzelllinie, die aus ventrikulärem Rattengewebe isoliert wurde, um unsere In-vitro-Plattform zu testen. H9C2-Zellen wurden auf Hydrogelsubstraten ausplattiert, die mit ECM-Protein Laminin beschichtet waren. Auf steifen Hydrogelen plattierte H9C2-Zellen zeigten einen signifikanten Anstieg der Drucksteifigkeit im Vergleich zu weichen Hydrogelen (p <0,05, ergänzende Abbildung 1a). Darüber hinaus ergaben immunhistochemische Studien einen signifikanten Anstieg von Lamin A, einem zellulären Marker für Steifheit, sowie des Mechanosensing-Proteins Vinculin (p < 0,05, ergänzende Abb. 1b–e)27,28,29. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine Änderung der Drucksteifigkeit der Hydrogelplattform ausreichte, um die Steifigkeit der Zellen zu ändern.

a Schematische Darstellung, die den strukturell-funktionalen Zusammenhang zwischen dem L-Typ-Kalziumkanal, dem Zytoskelettnetzwerk und den Mitochondrien in Wildkörper-Herzmuskelzellen zeigt. Gezielte Linkerstellen (1) α-Interaktionsdomäne (AID) des L-Typ-Calciumkanals, (2) Interaktionsstelle zwischen der β2-Untereinheit des L-Typ-Calciumkanals und AHNAK, (3) F-Aktin, (4) β-Tubulin, und (5) β1-Integrin. b Drucksteifigkeit (in kPa) von Polyacrylamid (PA)-Hydrogelen unter Herstellungsbedingungen (weich und steif), einschließlich Mittelwert ± SEM. c Drucksteifigkeit (in kPa) von auf weichen und steifen Hydrogelen plattierten Herzmuskelzellen im Gewicht, einschließlich Mittelwert ± SEM. Repräsentative Bilder und quantifizierte Datenpunkte für wt-Herzmuskelzellen, plattiert auf weichen und steifen Hydrogelen, gefärbt für Lamin A (d, e), Vinculin (f, g) und Integrin (h, i), einschließlich Mittelwert ± SEM. n = Anzahl der Zellen, N = Anzahl der Hydrogele. Statistische Signifikanz bestimmt durch Mann-Whitney-Tests.

Als nächstes führten wir Studien an Herzmuskelzellen durch, die aus 10 bis 15 Wochen alten Wildtyp-Mäusen (wt) isoliert wurden. Auf lamininbeschichteten weichen und steifen Hydrogelsubstraten plattierte Myozyten ergaben Steifigkeiten von etwa 2 bzw. 4 kPa (p < 0,05, Abb. 1c). Wichtig ist, dass diese Werte mit zuvor berichteten Messungen der Myokardsteifheit übereinstimmen, die bei 20–40-jährigen gesunden und HCM-Erwachsenen ermittelt wurden18. Auf steifen Hydrogelen plattierte Myozyten zeigten auch einen signifikanten Anstieg von Lamin A, Vinculin und β1-Integrin, der am häufigsten exprimierten Integrin-Isoform im postnatalen Herzen23,30 (p <0,05, Abb. 1d – i). Diese Daten deuten darauf hin, dass unsere In-vitro-Plattform den menschlichen Zustand angemessen widerspiegelt.

Wir haben zuvor gezeigt, dass cTnI-G203S-Herzmuskelzellen als Reaktion auf die Aktivierung des LTCC6,17 eine erhöhte mitochondriale Stoffwechselaktivität und Ψm aufweisen, die mit dem menschlichen Zustand übereinstimmen31. Hier untersuchten wir, ob es ausreicht, einfach wt-Herzmyozyten auf Hydrogele mit einer Steifigkeit zu plattieren, die das HCM-Myokard nachahmt, um diese Reaktionen widerzuspiegeln. Wir testeten die Auswirkung der Substratsteifigkeit auf die mitochondriale Stoffwechselaktivität und Ψm in Herzmuskelzellen, die aus 10 bis 15 Wochen alten Wildtiermäusen isoliert wurden, als Reaktion auf die Aktivierung des LTCC unter Verwendung des Kanalagonisten BayK(−). Die Stoffwechselaktivität hängt vom Sauerstoffverbrauch und dem mitochondrialen Elektronentransport entlang der Elektronentransportkette ab. Daher haben wir Veränderungen im mitochondrialen Elektronentransport in intakten Herzmuskelzellen gemessen, die mindestens 3 Stunden lang auf weichen und steifen Hydrogelen plattiert waren, indem wir Veränderungen in der Flavoproteinoxidation (als Autofluoreszenz) überwachten. Wir fanden heraus, dass sowohl auf weichen als auch auf steifen Hydrogelen plattierte wt-Myozyten nach Exposition gegenüber BayK(−) einen signifikanten Anstieg der Flavoproteinoxidation zeigten, im Vergleich zum (+)Enantiomer von BayK, das nicht als Agonist wirkt (BayK(+)) (Abb. 2a–c). Allerdings war das Ausmaß der BayK(−)-Reaktion bei steifen Hydrogelen im Vergleich zu weichen Hydrogelen deutlich größer. Wichtig ist, dass alle BayK(−)-induzierten Reaktionen durch die Anwendung des LTCC-Antagonisten Nisoldipin abgeschwächt werden konnten, was bestätigt, dass die LTCC die Reaktion vermittelte. Diese Daten deuten darauf hin, dass Veränderungen der ECM-Steifheit ausreichen, um die Regulierung der Mitochondrienfunktion durch das LTCC zu verändern.

Repräsentative ratiometrische Flavoprotein- (a, b) und JC-1-Fluoreszenz (e, f), aufgezeichnet von wt-Herzmuskelzellen, die auf weiche und steife Hydrogele plattiert wurden, vor und nach der Exposition gegenüber 10 μM BayK(+) oder 10 μM BayK(–) im Fehlen oder Vorhandensein von Nisoldipin (15 μM, Nisol). JC-1-Studien wurden unter kalziumfreien Bedingungen (0 mM Kalzium) durchgeführt. Pfeile zeigen die Zugabe von Medikamenten an. Um zu bestätigen, dass die Signale mitochondrialen Ursprungs waren, wurde am Ende jedes Flavoprotein-Experiments FCCP (50 μM) angewendet, um die Flavoprotein-Oxidation zu erhöhen. Am Ende jedes JC-1-Experiments wurde NaCN (40 mM) angewendet, um Ψm zu reduzieren. Gesamtfluoreszenz von Flavoprotein (c) und JC-1 (d) für alle Myozyten (n), die wie angegeben Arzneimitteln ausgesetzt waren, einschließlich Mittelwert ± SEM. d–h, Flavoprotein (d) und JC-1 (h) Fluoreszenz für Herzmuskelzellen (n, in Suspension), isoliert aus kardiomyopathischen cTnI-G203S-Mäusen und wt-Gegenstücken nach Exposition gegenüber BayK(+) oder 10 μM BayK(−)17 . Sämtliche statistische Signifikanz bestimmt durch Kruskal-Wallis-Tests oder Browne-Forsythe- und Welch-ANOVA-Test (i).

Um den Einfluss der Substratsteifigkeit auf die strukturell-funktionale Kommunikation zwischen Kanal und Mitochondrien zu untersuchen, haben wir auch Veränderungen von Ψm unter kalziumfreien Bedingungen untersucht. Obwohl die oxidative Phosphorylierung ein kalziumabhängiger Prozess ist, bleibt Ψm unter Bedingungen mit niedrigem intrazellulärem Kalzium (0–535 nM) stark polarisiert32,33. Tatsächlich zeigen Studien an Herzmuskelzellen von Mäusen und Meerschweinchen, dass die Aktivierung des LTCC durch Spannungsklemmen der Plasmamembran, Anwendung einer Lösung mit hohem K+-Gehalt oder BayK(−) zu einem Anstieg von Ψm führt, selbst in Abwesenheit von Kalzium9 . Die Depolymerisation von Aktin oder β-Tubulin mit Latrunculin A oder Colchicin oder das Fehlen von Dystrophin schwächt erhöhte Ψm ab, was darauf hindeutet, dass die Reaktion von einer intakten Zytoskelettarchitektur abhängt6,7,9,16. Hier stellten wir im Einklang mit den beobachteten Veränderungen der Flavoproteinoxidation fest, dass auf weiche und steife Hydrogele plattierte wt-Myozyten, die mindestens 3 Stunden lang in kalziumfreiem und EGTA-haltigem HBS inkubiert wurden, nach der Anwendung von BayK(−) beide einen signifikanten Anstieg von Ψm aufwiesen ) versus BayK(+) (Abb. 2e – g). Auch hier war die Stärke der BayK(−)-Reaktion bei steifen gegenüber weichen Hydrogelen deutlich größer. Alle BayK(–)-induzierten Reaktionen wurden mit Nisoldipin beseitigt, was bestätigt, dass die LTCC die Reaktion vermittelte. Diese Daten deuten darauf hin, dass Veränderungen der ECM-Steifigkeit ausreichen, um die strukturell-funktionale Kommunikation zwischen dem LTCC und den Mitochondrien zu verändern.

Bezeichnenderweise ahmten die Veränderungen der Stoffwechselaktivität und des Ψm, die bei Wildkörper-Myozyten beobachtet wurden, die auf steifen gegenüber weichen Hydrogelen ausplattiert waren, frühere Daten nach, die von cTnI-G203S im Vergleich zu Wildkörper-Herzmuskelzellen erhalten wurden (Abb. 2d, h)6,17. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine erhöhte ECM-Steifheit zum Fortschreiten der HCM-Pathophysiologie beitragen kann.

Wir untersuchten verschiedene „Linker“-Stellen zwischen dem LTCC und den Mitochondrien als potenzielle Mediatoren der Mitochondrienfunktion als Reaktion auf eine erhöhte Substratsteifheit. Wir fanden heraus, dass BayK(−)-induzierte Erhöhungen sowohl der Flavoprotein-Oxidation als auch von Ψm in Wildkörper-Myozyten, die auf weiche und steife Hydrogele plattiert waren, in Gegenwart eines Peptids, das speziell gegen das kardiale LTCC-AID abgeleitet war und die LTCC-β2-Untereinheit (AID-TAT) immobilisiert, signifikant abgeschwächt wurden Peptid, Abb. 1a) (Abb. 3a–f). Ähnliche Ergebnisse wurden in Gegenwart eines Peptids beobachtet, das auf die Interaktionsstelle zwischen der LTCC-β2-Untereinheit und AHNAK (AHNAK-P4N-TAT, Abb. 1a) abzielt (Abb. 3a – f). In ähnlicher Weise wurden durch BayK(−) induzierte Veränderungen sowohl der Flavoproteinoxidation als auch von Ψm in Gegenwart der Aktin- oder β-Tubulin-Depolymerisierungsmittel Latrunculin A bzw. Colchicin beseitigt (Abb. 3g – l). Diese Daten bestätigen ein wichtiges strukturell-funktionales Netzwerk zwischen dem kardialen LTCC und den Mitochondrien über das Zytoskelettnetzwerk, das die Mitochondrienfunktion unter Bedingungen veränderter ECM-Steifheit reguliert.

Repräsentative ratiometrische Flavoprotein- (a, b und g, h) und JC-1-Fluoreszenz (d, e und j, k), aufgezeichnet von wt-Herzmuskelzellen, die auf weiche und steife Hydrogele plattiert wurden, vor und nach der Exposition gegenüber 10 μM BayK(+), oder 10 μM BayK(−) in Abwesenheit oder Anwesenheit von AID-TAT (10 μM), AHNAK-P4N-TAT (1 μM), Latrunculin A (Latrunc, 5 μM, 20 Minuten Vorinkubation) oder Colchicin (Colch, 1 μM, 3 h Vorinkubation51). JC-1-Studien wurden unter kalziumfreien Bedingungen (0 mM Kalzium) durchgeführt. Pfeile zeigen die Zugabe von Medikamenten an. Um zu bestätigen, dass die Signale mitochondrialen Ursprungs waren, wurde am Ende jedes Flavoprotein-Experiments FCCP (50 μM) angewendet, um die Flavoprotein-Oxidation zu erhöhen. Am Ende jedes JC-1-Experiments wurde NaCN (40 mM) angewendet, um Ψm zu reduzieren. Gesamtfluoreszenz von Flavoprotein (c und i) und JC-1 (f und l) für alle Myozyten (n), die wie angegeben Arzneimitteln ausgesetzt waren, einschließlich Mittelwert ± SEM. Alle statistischen Signifikanzwerte wurden durch Kruskal-Wallis-Tests ermittelt.

Neben einer intrazellulären Verbindung zwischen LTCC und Mitochondrien über das Zytoskelettnetzwerk scheint auch eine strukturell-funktionale Verbindung zwischen ECM und F-Aktin über Integrin zu bestehen. Interessanterweise stellen wir hier fest, dass BayK(−)-induzierte Veränderungen sowohl bei der Flavoprotein-Oxidation als auch bei Ψm in Wildkörper-Myozyten, die auf weiche und steife Hydrogele plattiert waren, in Gegenwart eines murinen β1-Integrin-Funktionsblockierungsantikörpers (CD-29, Abb. 1a) signifikant abgeschwächt wurden ) (Abb. 4a–f). Insgesamt deuten diese Daten darauf hin, dass das kardiale LTCC und das Integrin als Partner an der Vermittlung der Mitochondrienfunktion unter Bedingungen der ECM-Steifheit beteiligt sein könnten, die den gesunden und HCM-Phänotyp imitieren. Wir haben dieses Netzwerk weiter erforscht, indem wir die intrazelluläre Steifheit manipuliert haben. Wir fanden heraus, dass die Einwirkung von Jasplakinolid, einem Arzneimittel, das F-Aktin stabilisiert und dadurch das Zytoskelett-Netzwerk34 stabilisiert, auf auf weiche und steife Hydrogele plattierte Wildtier-Myozyten ausreichte, um einen signifikanten Anstieg der Flavoprotein-Oxidation und von Ψm zu induzieren (Abb. 4g – l). Dies weist auf eine mögliche Rolle der Zytoskelettsteifheit bei der Regulierung der Mitochondrienfunktion unter beiden Bedingungen hin. Diese Ergebnisse werden durch Studien gestützt, die zeigen, dass Veränderungen in Zytoskelettproteinen ausreichen, um die Mitochondrienfunktion zu beeinflussen13,14,15.

Repräsentative ratiometrische Flavoprotein- (a, b und g, h) und JC-1-Fluoreszenz (d, e und j, k), aufgezeichnet von wt-Herzmuskelzellen, die auf weiche und steife Hydrogele plattiert wurden, vor und nach Exposition gegenüber 10 μM BayK(+), Jasplakinolid (Jasp, 1 μM, 20 Min. Vorinkubation) oder 10 μM BayK(−) in Abwesenheit oder Anwesenheit von CD-29 (5 μg/ml, 30 Min. Vorinkubation). JC-1-Studien wurden unter kalziumfreien Bedingungen (0 mM Kalzium) durchgeführt. Pfeile zeigen die Zugabe von Medikamenten an. Um zu bestätigen, dass die Signale mitochondrialen Ursprungs waren, wurde am Ende jedes Flavoprotein-Experiments FCCP (50 μM) angewendet, um die Flavoprotein-Oxidation zu erhöhen. Am Ende jedes JC-1-Experiments wurde NaCN (40 mM) angewendet, um Ψm zu reduzieren. Gesamtfluoreszenz von Flavoprotein (c und i) und JC-1 (f und l) für alle Myozyten (n), die wie angegeben Arzneimitteln ausgesetzt waren, einschließlich Mittelwert ± SEM. Alle statistischen Signifikanzwerte wurden durch Kruskal-Wallis-Tests bestimmt.

Wir untersuchten die Reversibilität des hypermetabolischen mitochondrialen cTnI-G203S-Zustands, der sich aus der cTnI-Mutation Gly203Ser ergibt, indem wir den Effekt der Verringerung der Substratsteifigkeit auf Ψm und die mitochondriale Stoffwechselaktivität in Herzmuskelzellen testeten, die aus cTnI-G203S-Mäusen mit etabliertem HCM isoliert wurden. cTnI-G203S-Mäuse zeigen ab einem Alter von 21 Wochen charakteristische Merkmale von HCM, einschließlich Hypertrophie und Hyperkontraktilität5,6,17,35. Daher wurden 30–50 Wochen alte cTnI-G203S-Herzmuskelzellen und altersentsprechende Herzmuskelzellen vom Gewicht auf steife und weiche Hydrogele für mindestens 3 Stunden plattiert, um angeborene HCM bzw. gesunde Zustände nachzuahmen. Anschließend wurden Veränderungen der Zellsteifheit und der Mitochondrienfunktion beurteilt. In Übereinstimmung mit den Daten von 10 bis 15 Wochen alten Herzmuskelzellen zeigten 30–50 Wochen alte Muskelzellen, die auf steifen Hydrogelen plattiert waren, einen signifikanten Anstieg der Drucksteifigkeit im Vergleich zu weichen Hydrogelen (p < 0,05, Abb. 5a). Darüber hinaus zeigten 30–50 Wochen alte cTnI-G203S-Myozyten, die auf weichen Hydrogelen plattiert waren, eine signifikante Abnahme der Drucksteifigkeit im Vergleich zu solchen, die auf steifen Hydrogelen plattiert waren (p < 0,05, Abb. 5a). Diese Daten zeigen, dass die Drucksteifigkeit von Wildkörper-Herzmuskelzellen manipuliert werden kann, um die von cTnI-G203S-Myozyten zu imitieren, und umgekehrt. In Übereinstimmung mit dem HCM-Phänotyp wurden bei cTnI-G203S im Vergleich zu wt-Myozyten übertriebene Reaktionen beobachtet, wenn sie auf weiche oder steife Bedingungen ausplattiert wurden (Abb. 5a). Während keine Veränderung der Lamin A- oder Vinculin-Expression beobachtet wurde, führte das Ausplattieren von cTnI-G203S-Myozyten auf weiche Hydrogele zu einer signifikanten Abnahme der β1-Integrin-Expression (Abb. 5b – g), was darauf hindeutet, dass Integrin ein wichtiges mechanosensierendes Protein in cTnI-G203S-Myozyten ist .

a Drucksteifigkeit (in kPa) von Herzmuskelzellen, die aus kardiomyopathischen cTnI-G203S-Mäusen und wt-Gegenstücken isoliert wurden, die auf weiche und steife Hydrogele plattiert wurden, einschließlich Mittelwert ± SEM. b–g Repräsentative Bilder und quantifizierte Datenpunkte für cTnI-G203S-Herzmuskelzellen, plattiert auf steifen und weichen Hydrogelen, gefärbt für Lamin A (b, c), Vinculin (d, e) und Integrin (f, g), einschließlich Mittelwert ± SEM . n = Anzahl der Zellen, N = Anzahl der Gele. Sämtliche statistische Signifikanz bestimmt durch Mann-Whitney-Tests oder Kruskal-Wallis-Test (a).

Wir haben auch Veränderungen der mitochondrialen Stoffwechselaktivität und Ψm in Herzmuskelzellen gemessen, die aus 30–50 Wochen alten cTnI-G203S-Mäusen isoliert wurden, die auf steifen und weichen Hydrogelen plattiert waren, als Reaktion auf die Aktivierung des LTCC mithilfe von BayK(−). Wir fanden heraus, dass sowohl auf steifen als auch auf weichen Hydrogelen plattierte cTnI-G203S-Myozyten nach Exposition gegenüber BayK(-) gegenüber BayK(+) einen signifikanten Anstieg der Flavoproteinoxidation und des Ψm zeigten (Abb. 6a – f). Das Ausmaß der BayK(−)-Reaktion war bei weichen gegenüber steifen Hydrogelen signifikant verringert, was darauf hindeutet, dass die ECM-Steifheit eine entscheidende Rolle bei der Regulierung von Veränderungen der Mitochondrienfunktion in der cTnI-G203S-Pathophysiologie spielt. Alle durch BayK(−) induzierten Reaktionen konnten durch die Anwendung von Nisoldipin oder AID-TAT abgeschwächt werden (Abb. 6a – f), was bestätigt, dass eine strukturell-funktionale Kommunikation zwischen dem LTCC und den Mitochondrien die Reaktion vermittelt. Darüber hinaus wurden durch BayK(−) induzierte Veränderungen der Flavoproteinoxidation und von Ψm in Gegenwart von CD-29 deutlich abgeschwächt, wohingegen die alleinige Anwendung von Jasplakinolid ausreichte, um einen signifikanten Anstieg der Flavoproteinoxidation und von Ψm zu induzieren (Abb. 6g – l). . Zusammengenommen legen diese Daten nahe, dass das kardiale LTCC und das Integrin als Partner an der Vermittlung des hypermetabolischen mitochondrialen Zustands beteiligt sein könnten, den cTnI-G203S-Myozyten aufweisen.

Repräsentatives ratiometrisches Flavoprotein (a, b und g, h) und JC-1 (d, e und j, k) fluoreszieren aufgezeichnete Herzmuskelzellen, die aus kardiomyopathischen cTnI-G203S-Mäusen isoliert wurden, die vor und nach der Exposition gegenüber 10 μM BayK auf steifen und weichen Hydrogelen ausplattiert wurden (+), Jasplakinolid (Jasp, 1 μM, 20 Minuten Vorinkubation) oder 10 μM BayK(−) in Abwesenheit oder Anwesenheit von Nisoldipin (15 μM, Nisol), AID-TAT (10 μM) oder CD- 29 (5 μg/ml, 30 Minuten Vorinkubation). JC-1-Studien wurden unter kalziumfreien Bedingungen (0 mM Kalzium) durchgeführt. Pfeile zeigen die Zugabe von Medikamenten an. Um zu bestätigen, dass die Signale mitochondrialen Ursprungs waren, wurde am Ende jedes Flavoprotein-Experiments FCCP (50 μM) angewendet, um die Flavoprotein-Oxidation zu erhöhen. Am Ende jedes JC-1-Experiments wurde NaCN (40 mM) angewendet, um Ψm zu reduzieren. Gesamtfluoreszenz von Flavoprotein (c und i) und JC-1 (f und l) für alle Myozyten (n), die wie angegeben Arzneimitteln ausgesetzt waren, einschließlich Mittelwert ± SEM. Alle statistischen Signifikanzwerte wurden durch Kruskal-Wallis-Tests ermittelt.

Um die Rolle von LTCC und β1-Integrin beim Fortschreiten der Krankheit weiter zu untersuchen, haben wir die Expressionsniveaus von LTCC und β1-Integrin im Gesamtherzhomogenat von prä- und postkardiomyopathischen cTnI-G203S-Mäusen untersucht. Wir fanden keinen signifikanten Unterschied in der LTCC-Expression in prä- und postkardiomyopathischen cTnI-G203S-Herzen oder altersentsprechenden wt-Herzen (Abb. 7a, b und ergänzende Abb. 2). Allerdings wurden Veränderungen der β1-Integrin-Expression in prä- und postkardiomyopathischen cTnI-G203S-Herzen im Vergleich zu wt beobachtet, wobei die deutlichsten Anstiege in postkardiomyopathischen Herzen auftraten (Abb. 7c, d und ergänzende Abb. 2). Insgesamt scheinen sich Veränderungen der Integrinexpression spät im Fortschreiten der cTnI-G203S-HCM-Erkrankung zu „verschlechtern“. Dies könnte ein Hinweis auf einen maladaptiven Zustand sein36.

Immunblot-Analyse der L-Typ-Kalziumkanal- (a, b) und β1-Integrin- (c, d) Proteinexpression, durchgeführt an einem Gesamtherzhomogenat, gepoolt aus Gruppen von 5 prä- (10–15 Wochen alten) oder postkardiomyopathischen (30). –50 Wochen alte) cTnI-G203S-Mäuse und altersentsprechende Wildtier-Gegenstücke. Repräsentative Immunoblots, die mit dem L-Typ-Kalziumkanal-α1C-Untereinheits- (CaV1.2, a) oder β1-Integrin-Antikörper (c) und anschließend mit dem monoklonalen GAPDH-Antikörper untersucht wurden. Densitometrieanalyse der Proteinexpression von CaV1.2 (b) oder β1-Integrin (d), normalisiert auf die assoziierte GAPDH-Expression. n = Anzahl der technischen Wiederholungen. Eine Browne-Forsythe- und Welch-ANOVA (b) oder ein Kruskal-Wallis-Test (d) ermittelten die statistische Signifikanz. Densitometrische Analyse der relativen mTOR-Expression (berechnet als Phospho-mTOR/Gesamt-mTOR), durchgeführt an zytoplasmatischen (e) und nuklearen (f) Fraktionen, die aus Gruppen von fünf prä- oder postkardiomyopathischen cTnI-G203S-Mäusen und altersentsprechenden Wildtier-Gegenstücken gepoolt wurden. β-Tubulin- und Histon-H2B-Antikörper wurden als Ladungskontrollen für zytoplasmatische bzw. nukleare Fraktionen verwendet. n = Anzahl der technischen Wiederholungen. Eine Browne-Forsythe- und Welch-ANOVA (e) oder ein Kruskal-Wallis-Test (f) ermittelten die statistische Signifikanz. g Schematische Darstellung, die den strukturell-funktionalen Zusammenhang zwischen dem L-Typ-Kalziumkanal, dem Zytoskelettnetzwerk, den Mitochondrien, dem Integrin und der extrazellulären Matrix in wt- und cTnI-G203S-Herzmuskelzellen zeigt. Eine gestörte Zytoskelettarchitektur in cTnI-G203S-Herzmuskelzellen kann einen maladaptiven Rückkopplungsmechanismus zwischen erhöhter Steifheit des Zytoskeletts und der extrazellulären Matrix auslösen, was zu einem hypermetabolischen mitochondrialen Zustand führt.

Das Säugetierziel von Rapamycin (mTOR) ist ein kalziumunabhängiger Signalweg, der ein wichtiger Regulator der Proteinsynthese, der mitochondrialen Biogenese und des Zellstoffwechsels ist und an der Entwicklung von HCM beteiligt ist37,38,39. Aus cTnI-G203S-Mäusen isolierte Myozyten zeigen im Vergleich zu Wildkörper-Myozyten eine Zunahme der mitochondrialen Größe und Dichte, jedoch keine Veränderung der intrazellulären Calciumkonzentration2,3. Daher haben wir hier die Beteiligung von mTOR an der Entwicklung einer cTnI-G203S-Kardiomyopathie getestet. Veränderungen in der LTCC-vermittelten mitochondrialen Stoffwechselaktivität und ein daraus resultierender hypermetabolischer mitochondrialer Zustand treten vor der Entwicklung einer cTnI-G203S-Pathologie auf6,17. Um festzustellen, ob Veränderungen in der Proteinexpression früh oder spät im Krankheitsverlauf auftreten, haben wir die mTOR-Expression in zytoplasmatischen und nuklearen Fraktionen untersucht, die aus Herzen von prä- und postkardiomyopathischen cTnI-G203S-Mäusen hergestellt wurden. Die Expression von phosphoryliertem mTOR (Phospho-mTOR) wurde auf das Gesamt-mTOR normalisiert, um eine „relative“ mTOR-Expression zu erhalten (einzelne Phospho-mTOR- und Gesamt-mTOR-Daten finden Sie in den ergänzenden Abbildungen 3 und 4). Wir fanden heraus, dass die relative mTOR-Expression in postkardiomyopathischen cTnI-G203S- und wt-Zytoplasma- (Abb. 7e) und Kernfraktionen (Abb. 7f) signifikant erhöht war; Dies stützt die Annahme, dass mTOR eine Rolle im „normalen“ Herzalterungsprozess spielen könnte37. Bemerkenswert ist jedoch, dass die relative mTOR-Expression sowohl in prä- als auch postkardiomyopathischen cTnI-G203S-Kernfraktionen im Vergleich zu altersentsprechenden Wildkörper-Gegenstücken signifikant erhöht war (Abb. 7f). Diese Daten legen nahe, dass die Aktivierung von mTOR auch zur frühen Phase der Krankheit beitragen könnte. Allerdings wären weitere funktionelle Studien unter Nutzung der in dieser Studie beschriebenen Plattformen erforderlich, um eine kausale Rolle von mTOR beim Fortschreiten der Krankheit zu bestätigen.

Ein intrazellulärer „Kommunikationszusammenbruch“ zwischen dem LTCC und den Mitochondrien trägt zu einem hypermetabolischen mitochondrialen Zustand bei, der aus cTnI- und β-Myosin-Schwerkette-Genmutationen entsteht6,17,31. Diese Reaktionen gehen der Entwicklung von HCM voraus. Eine erhöhte ECM-Proteinsynthese wurde mit dem Fortschreiten der menschlichen HCM-Pathologie in Verbindung gebracht20,21,22. Mithilfe einer In-vitro-Plattform, die die Steifheit des HCM-Myokards nachahmt, zeigen wir hier, dass Veränderungen der Substratsteifigkeit die strukturell-funktionale Kommunikation zwischen LTCC und Mitochondrien modulieren können. Dies scheint sowohl unter gesunden als auch unter HCM-Bedingungen über wichtige „Linker“-Stellen innerhalb des Zytoskelettnetzwerks zu geschehen (Abb. 2 und 6). Damit schlagen wir vor, dass eine erhöhte ECM-Steifheit vor dem LTCC zum Fortschreiten der HCM-Pathophysiologie aufgrund der Gly203Ser-Genmutation beitragen könnte. Um dies zu untermauern, weisen künstlich hergestellte Herzgewebe, die durch die Aussaat gesunder, aus menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen gewonnener Herzmuskelzellen auf Streifen dezellularisierten Myokards, die aus einem Schweinemodell von HCM gewonnen wurden, erzeugt wurden, eine erhöhte Steifheit auf21.

Wir stellen fest, dass die Hemmung des Mechanosensing-Proteins β1-Integrin LTCC-induzierte Veränderungen der mitochondrialen Stoffwechselaktivität aufhob, während eine Erhöhung der Zytoskelettsteifheit LTCC-induzierte Veränderungen der Mitochondrienfunktion simulierte (Abb. 4 und 6). Interessanterweise sind das kardiale LTCC und das β1-Integrin Transmembran-durchdringende Proteine, die strukturell und funktionell mit F-Aktin assoziiert sind12,23,25,26. Es gibt gute Belege dafür, dass die kardiale Mechanotransduktion sowohl von innen nach außen als auch von außen nach innen erfolgt40,41. Damit schlagen wir einen Rückkopplungsmechanismus zwischen der ECM und dem Zytoskelettnetzwerk über Integrin vor, der bei der Regulierung von Veränderungen der LTCC-vermittelten mitochondrialen Funktion unter gesunden Bedingungen hilft, jedoch als Reaktion auf die sarkomerische Genmutation Gly203Ser maladaptiv wird und dadurch am Fortschreiten der Erkrankung beteiligt ist HCM-Erkrankungszustand (Abb. 7g). Um die Auswirkung von Veränderungen der Substratsteifigkeit auf die Regulierung der Mitochondrienfunktion durch das LTCC sowohl unter gesunden als auch unter HCM-Bedingungen zu beurteilen, wurden alle Studien in dieser Arbeit an ruhenden Herzmuskelzellen durchgeführt. Um die metabolische regulatorische Rolle der strukturell-funktionalen Verbindung zwischen LTCC und Mitochondrien zu untersuchen, wurden außerdem Veränderungen von Ψm unter kalziumfreien Bedingungen durchgeführt. Zukünftige Studien mit Messungen der Kontraktilität wären erforderlich, um die Rolle der ECM-Steifheit auf die in dieser Studie identifizierten Mechanismen weiter aufzuklären.

Genetische Studien haben über 1500 verschiedene Sarkomer-Genmutationen identifiziert, die mit der Entwicklung von HCM4 verbunden sind. Eine Überprüfung von Studien zur HCM-Pathophysiologie ergab, dass zwar einige Ähnlichkeiten bestehen, jede Mutation jedoch zu einer mutationsspezifischen Pathophysiologie zu führen scheint42. Daher wären weitere Untersuchungen erforderlich, um die Beteiligung des vorgeschlagenen Mechanismus an der Entwicklung spezifischer HCM, die sarkomerische Genmutationen verursacht, zu bestätigen. Aus therapeutischer Sicht stellt die Behandlung von cTnI-G203S-Mäusen mit AID-TAT die LTCC-Kinetik und die mitochondriale Stoffwechselaktivität wieder her und verhindert die Entwicklung einer Hypertrophie17. Andere Studien, die sich mit der Proteomanalyse von Herzgewebe von HCM-Patienten mit identifizierten sarkomeren Genmutationen befassen, legen nahe, dass das Mikrotubuli-Netzwerk ein potenzielles Behandlungsziel ist43. Diese Ergebnisse stützen die Annahme, dass die gezielte gezielte zelluläre Reaktion auf die ECM-Steifheit ein wichtiger Gesichtspunkt bei der Entwicklung präventiver Therapien sein könnte44. Mit einer weiteren Charakterisierung könnten wichtige „Linker“-Stellen zwischen dem LTCC und den Mitochondrien und/oder modifizierenden sarkomeren Proteinen potenzielle therapeutische Ziele für die Entwicklung von HCM-Behandlungsansätzen für Patienten mit identifizierten sarkomeren Genmutationen darstellen.

Polyacrylamid (PA)-Hydrogele wurden auf der Grundlage einer zuvor beschriebenen Methode45 hergestellt. Vorpolymerlösungen für Hydrogele, die gesundes (weiches) und HCM-Myokard (steifes) nachahmen, wurden durch Kombination von Acrylamid (Bio-Rad), Bisacrylamid (Bio-Rad), Dulbeccos PBS (Mg2+ und Ca2+ frei) (Life Technologies) und hergestellt entionisiertes H2O (Rezept siehe Tabelle 1). Deckgläser wurden gereinigt und in einem Ozonreiniger für 1 Minute auf jeder Seite (Bioforce Nanosciences UV/Ozone ProCleaner) aktiviert und dann für 5 Minuten in einer Lösung mit 3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat (0,5 % V/V) (Merck) funktionalisiert. , Eisessig (3 % V/V) und reines Ethanol (96,5 % V/V). Funktionalisierte Deckgläser wurden 1 Minute lang in Ethanol gespült und an der Luft trocknen gelassen, dann mit Dimethyldichlorsilan (DCDMS) beschichtet, um eine flache, nicht klebende Oberfläche zur Herstellung von Hydrogelen zu schaffen. Anschließend wurde eine Polymerlösung hergestellt, indem 10 µl Ammoniumpersulfat (APS) (Bio-Rad) und 1 µl N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED) (Bio-Rad) zu 1 ml Prä- Polymerlösung. Als nächstes wurden 4 oder 12 µl Polymerlösung auf DCDMS-beschichtete Glasobjektträger pipettiert, um eine Endhöhe von 50 µm zu erreichen (für runde Deckgläser mit 10 mm Durchmesser bzw. quadratische Deckgläser mit 15 × 15 mm2). Anschließend wurden funktionalisierte Deckgläser vorsichtig darauf gelegt. Man ließ die Hydrogele 20 Minuten lang polymerisieren, bevor die Deckgläser von den DCDMS-beschichteten Objektträgern entfernt und UV-sterilisiert wurden.

Hydrogele wurden dreimal in 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinethansulfonsäurepuffer (HEPES) (50 mM, pH 8,5) (Life Technologies) gespült und dann in N-Sulfosuccinimidyl-6-(4′-azido-2) eingetaucht ′-Nitrophenylamino)hexanoat (Sulfo-SANPAH; Thermo Scientific) in HEPES (1 mg/ml). Sulfo-SANPAH wurde unter UV-Licht (365 nm, 10 Min.) aktiviert, dann entfernt und die Hydrogele in HEPES gespült. Anschließend wurden die Hydrogele in Maus-Laminin (ThermoFisher 23017015) in HEPES (25 µg/ml) getaucht und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Vor der Verwendung wurden Hydrogele mit PBS gespült, um ungebundenes Laminin zu entfernen.

Rasterkraftmikroskopie (AFM) wurde verwendet, um die Drucksteifigkeit von Hydrogelen und Einzelzellen zu messen, gemessen in Young-Modulen. Die Messungen wurden mit einem MFP-3D-Rasterkraftmikroskop (Asylum Research) unter Verwendung von 200 µm Chrom/Gold-beschichteten Pyrex-Nitrid-Auslegern mit dreieckigen Spitzen (Nano World Modell PNP-TR) durchgeführt. Die Messungen wurden in 1× PBS (Mg2+ und Ca2+ frei) durchgeführt und mit 2nN-Eindrücken sondiert (Annäherungsgeschwindigkeit: 2 µm/s, Rückzugsgeschwindigkeit: 10 µm/s). Der lineare Teil der durch den Kontakt erzeugten Kraftkurve wurde verwendet, um den Elastizitätsmodul durch benutzerdefinierten Code in Igor Pro zu bestimmen, wie zuvor beschrieben46. Um die Stabilität der Messungen sicherzustellen, wurden Eindrücke in dreifacher Ausfertigung hergestellt und gemittelt, um eine durchschnittliche Steifigkeit pro Eindruck zu erhalten. Sechs Punkte auf jedem Hydrogel wurden zufällig ausgewählt und eingekerbt. Der Durchschnitt dieser sechs Vertiefungen wurde als Schätzung der gesamten Drucksteifigkeit des Hydrogels verwendet47. Es wurden zwei technische Wiederholungen pro biologischer Wiederholung charakterisiert, um sicherzustellen, dass die Hydrogele eine gleichmäßige Steifheit aufwiesen. Die Steifheit der Zellen wurde durch die Einkerbung der Mitte einzelner Zellen charakterisiert. Ungefähr 28 Zellen wurden pro biologischer Wiederholung eingerückt27,48. Für die Einzelzellsteifigkeit wurden pro biologischer Wiederholung vier technische Wiederholungen durchgeführt. Pro Bedingung wurden mindestens vier biologische Wiederholungen durchgeführt.

Die aus ventrikulärem Rattengewebe isolierte H9C2-Myoblastenzelllinie wurde von der European Collection of Cell Cultures (ECACC, Salisbury, Vereinigtes Königreich) geliefert und von CellBank Australia (Westmead, NSW, Katalognummer 88092904) erworben. H9C2-Zellen wurden gemäß den ECACC-Anweisungen kultiviert. Die Zellen wurden in vollständigem Wachstumsmedium, bestehend aus Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, hoher Glucosegehalt, Pyruvat, ThermoFisher), ergänzt mit 4 mM Glutamin und 10 % fötalem Kälberserum, wiederbelebt. Die Zellen wurden mit 1–3 × 10.000 Zellen/cm2 ausgesät. Der Medienwechsel wurde alle 2–3 Tage durchgeführt. Die Subkultivierung wurde bei einer Konfluenz von ca. 70–80 % durchgeführt. Zur Subkultur oder Ausplattierung auf PA-Hydrogelen wurde DMEM entfernt und verworfen, durch 0,25 % Trypsin-EDTA (ThermoFisher) ersetzt und etwa 3 Minuten lang (37 °C) inkubiert, bevor die Zellsuspension bei 1200 U/min (5 Minuten) zentrifugiert wurde. Anschließend wurde der Überstand entfernt und das Pellet in vorgewärmtem Vollwachstumsmedium resuspendiert. Für PA-Hydrogele wurden Zellen mit 10.000 Zellen pro Hydrogel (weich oder steif) ausplattiert und vor dem Experiment 24–48 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.

Für alle Studien wurden männliche Mäuse verwendet. Es wurden erwachsene Herzmuskelzellen verwendet, die aus Mäusen isoliert wurden, die das menschliche cTnI-Gen exprimierten, das für die menschliche HCM kodiert, die die Mutation cTnI-G203S verursacht. Die Mäuse entwickeln in der 21. Woche typische HCM-Merkmale5,6,17,35. Für In-vitro- und Ex-vivo-Studien wurden 10–15 Wochen alte (präkardiomyopathische) und 30–50 Wochen alte (postkardiomyopathische) cTnI-G203S-Mäuse verwendet. Als Kontrollen (wt) wurden altersentsprechende Mäuse verwendet, die das normale menschliche cTnI-Gen exprimierten. Männliche Mäuse wurden verwendet, um mögliche Unterschiede in den Reaktionen aufgrund des Geschlechts zu beseitigen. Die Experimente wurden an insgesamt 74 10–15 Wochen alten Wildtiermäusen, zehn 10–15 Wochen alten cTnI-G203S-Mäusen, sechzehn 30–50 Wochen alten Wildtiermäusen und 45 30–15 Wochen alten Wildtiermäusen durchgeführt. 50 Wochen alte cTnI-G203S-Mäuse. Alle Tiere wurden zufällig den Behandlungsgruppen zugeordnet. Alle Tierstudien wurden von der Tierethikkommission der University of Western Australia gemäß dem australischen Verhaltenskodex für die Pflege und Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke (NHMRC, 8. Auflage, 2013) genehmigt.

Erwachsene Herzmuskelzellen wurden wie zuvor beschrieben aus Wildtier- und cTnI-G203S-Mäusen isoliert16,17,49. Mäuse wurden mit Pentobarbiton-Natrium (240 mg/kg, über intraperitoneale Injektion) anästhesiert, dann wurden die Herzen herausgeschnitten und über die Aorta mit einer Kanüle in einen Langendorff-Apparat eingeführt. Die Herzen wurden mit Krebs-Henseleit-Puffer (KHB) perfundiert, der (in mM) enthielt: 120 NaCl, 25 NaHCO3, 4,8 KCl, 2,2 MgSO4, 1,2 NaH2PO4 und 11 Glucose (pH = 7,35 mit O2/CO2 bei 37 °C) für: 4 Min. bei 37 °C, dann 3 Min. in Gegenwart von 2,4 mg/ml Kollagenase B, dann 8 Min. in Gegenwart von 40 μM Calcium. Nach der Perfusion wurde das Ventrikelgewebe auseinandergezogen und verrieben, um die Myozyten in Suspension zu dissoziieren. Die Myozytensuspension wurde 20 Minuten lang absetzen gelassen, der Überstand verworfen und die Myozyten in kalziumfreier Hepes-gepufferter Lösung (HBS) resuspendiert, die (in mM) enthielt: 5,3 KCl, 0,4 MgSO4·7H2O, 139 NaCl, 5,6 Na2HPO4·2H2O, 5 Glucose , 20 Hepes und 2 Glutamin (pH = 7,4 bei 37 °C) in Gegenwart oder Abwesenheit von 3 mM EGTA (für 0 mM Calcium-Experimente). Für kalziumhaltige Experimente wurde Kalzium zurücktitriert, um eine endgültige extrazelluläre Konzentration von 1,8 mM zu erreichen. Myozytensuspensionen wurden auf Hydrogele ausplattiert und vor dem Experimentieren mindestens 3 Stunden lang bei 37 ° C inkubiert. Alle In-vitro-Studien wurden in frisch isolierten ruhenden Myozyten bei 37 °C durchgeführt.

Die Zellen wurden für die konfokale Bildgebung basierend auf zuvor beschriebenen Methoden vorbereitet7,16. Nach dem Ausplattieren und Inkubieren wurden H9C2-Zellen oder erwachsene Herzmuskelzellen dreimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gewaschen, die in mM Folgendes enthielt: 13 KCl, 7,35 KH2PO4, 0,69 NaCl, 40,4 und 40,4 Na2HPO4·7H2O (pH = 7,4) und dann fixiert mit 4 % Paraformaldehyd (PFA, in PBS, für 15 Min.) und permeabilisiert mit 0,3 % Triton X-100 (15 Min.). Nach der Permeabilisierung wurden die Zellen 1 Stunde lang bei 37 °C in einer Blockierungslösung mit 5 % Ziegenserum und 5 % Pferdeserum (in PBS) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit den Primärantikörpern Lamin A (1:400, Abcam, ab26300) und Vinculin (1:200, Abcam, ab130007) in 5 % BSA (in PBS, 1 Stunde bei 37 °C) inkubiert. Die Zellen wurden dann mit Rhodamin-Phalloidin (TRITC, 1:400, ThermoFisher, R415), Goat F(ab) Anti-Rabbit IgG H&L (FITC, 1:200, Abcam ab7050) und Goat Anti-Mouse IgG H&L (Alexa Fluor®) inkubiert 647, 1:200, Abcam ab150115) in 5 % BSA (in PBS, 1 h bei 37 °C). Alternativ wurden die Zellen mit einem β1-Integrin-Primärantikörper (1:100, ThermoFisher MA1-06906) in 5 % BSA (in PBS, 1 Stunde bei 37 °C) inkubiert, gefolgt von Ziegen-Anti-Maus-IgG H&L (Alexa Fluor® Plus). 488, 1:400, ThermoFisher A32723) in 5 % BSA (in PBS, 1 h bei 37 °C). Abschließend wurden die Zellen mit der Nukleinsäurefärbung DAPI (1:200 in PBS, Sigma-Aldrich D9542) 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie zur Bildgebung auf Objektträger montiert wurden. Die Zellen wurden auf einem inversen Fluoreszenzmikroskop Olympus IX71 bei 60-facher Vergrößerung abgebildet.

5,5′,6,6′-Tetrachlor-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyaniniodid (JC-1) wurde von Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA) gekauft. Carbonylcyanid-4-(trifluormethoxy)phenylhydrazon (FCCP), Colchicin, Latrunculin A, Nisoldipin, (S)-(−)-Bay K8644 (BayK(−)) und Natriumcyanid (NaCN) wurden von Merck (Kenilworth, New) gekauft Jersey, USA). Jasplakinolid wurde von Cayman Chemical (Ann Arbor, Michigan, USA) gekauft; (R)-(+)-Bay K8644 (BayK(+)) von BioVision (Milpitas, Kalifornien, USA); und CD-29 von BD Biosciences (Franklin Lakes, New Jersey, USA). Das AID-TAT-Peptid wurde unter Verwendung der Aminosäuresequenz QQLEEDLKGYLDWITQAE einschließlich einer zelldurchdringenden TAT-Sequenz (RKKRRQRRR) synthetisiert, die über 6-Aminohexansäure (AusPep, Tullamarine, Victoria, AUS)50 gebunden ist. Das AHNAK-P4N-TAT-Peptid wurde unter Verwendung der Aminosäuresequenz KGKHGKLKFGTFGGLGSKSKGHYEVT synthetisiert, die wie zuvor beschrieben an die TAT-Sequenz gebunden war (Mimotopes Pty Ltd, Victoria, AUS).

Das mitochondriale Membranpotential (Ψm) wurde unter Verwendung des Fluoreszenzindikators JC-1 (200 nM, Inkubationszeit = 3 h, ex = 480 nm, em = 580/535 nm, Intervall = 2 min, Exposition = 50 ms) bewertet16,17. Am Ende jedes Experiments wurde der mitochondriale Elektronentransportblocker Natriumcyanid angewendet, um Ψm zu kollabieren, was bestätigte, dass das JC-1-Signal auf Ψm (NaCN, 40 mM) hinweist. Die mitochondriale Flavoproteinoxidation wurde durch Aufzeichnung der Myozyten-Autofluoreszenz wie zuvor beschrieben beurteilt (ex = 480 nm, em = 535 nm, Intervall = 1 Minute, Exposition = 250 ms)16,17. Am Ende jedes Experiments wurde der mitochondriale Elektronentransportketten-Entkoppler FCCP (50 μM) zugegeben, um die Flavoproteinoxidation zu erhöhen, was bestätigte, dass das Signal mitochondrialen Ursprungs war. Die gesamte In-vitro-Fluoreszenz wurde mit einer Andor Zyla SCMOS 5,5 MP-Kamera gemessen, die an ein umgekehrtes Nikon TE2000-U-Mikroskop angeschlossen war. Ratiometrische JC-1- oder Flavoprotein-Fluoreszenzbilder wurden mit Metamorph 7.10 quantifiziert. Regionen, die Myozyten enthalten, wurden manuell verfolgt, um ein Fluoreszenzsignal für jede Zelle zu erhalten. Ein äquivalenter Bereich, der keine Zellen enthielt, wurde als Hintergrund verwendet und für jede Zelle subtrahiert. Die Reaktionen auf die Behandlungen wurden als prozentualer Anstieg oder Rückgang gegenüber dem (Basal-)Durchschnitt vor der Behandlung angegeben.

Die Proteinkonzentration aller Proben wurde mithilfe des Bradford-Proteintests unter Verwendung von BSA als Standard quantifiziert. 25 µg Proben wurden in vorgefertigtes 10 %iges BIO-RAD Mini-PROTEAN® TGX Stain-FreeTM SDS-Polyacrylamidgel (Bio-RAD Laboratories) geladen und dann elektrophoretisch auf eine 0,2 µm Nitrozellulosemembran übertragen (Trans-Blot® TurboTM Transfer Pack, Bio-RAD Laboratories). RAD Laboratories) mit dem Bio-RAD Trans-Blot® TurboTM Transfersystem. Die Blots wurden zwischen jedem erneuten Sondierungsschritt mit Stripping-Puffer, bestehend aus (in mM): Tris HCl pH 6,8: 62,5, 2-Mercaptoethanol: 100, 2 % SDS, 30 Min. bei 50 °C, gestrippt. Die quantitative Densitometrie wurde an Bildern durchgeführt, die mit einem Chemidoc-Bildgebungssystem (Bio-rad) und der ImageJ-Software aufgenommen wurden. Die Daten werden als optische Dichte der Proteinexpression dargestellt, normalisiert auf die im selben Blot nachgewiesene Ladungskontrolle.

Die Immunoblot-Analyse wurde mit dem gesamten Herzhomogenat durchgeführt, das aus Gruppen von fünf 10–15 Wochen alten und 30–50 Wochen alten Wildtier- und cTnI-G203S-Mäusen gepoolt wurde. Kurz gesagt, schockgefrorene Herzen wurden gewogen, mit Mörser und Pistill in flüssigem N2 zu einem feinen Pulver gemahlen und in 1:4 RIPA-Puffer, bestehend aus (in mM): NaCl 150, Tris 50, Na4P2O7 20, Na3VO4 2, NaF, homogenisiert 1, 0,5 % Na-Desoxycholat, 1 % Triton ) Hemmstofftabletten. Das gesamte Herzhomogenat wurde dann 5 Minuten lang bei 4 ° C und 10.000 g zentrifugiert. Die Blots wurden mit den folgenden Primärantikörpern sondiert: polyklonaler Kaninchen-Anti-CaV1.2 (Alomone, ACC-003, 1:200) oder monoklonaler Kaninchen-Anti-β1-Integrin (D6S1W) (Cell Signaling Technology 34971, 1:1000). Als Beladungskontrolle wurde monoklonaler Kaninchen-Anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, 2118, 1:1000) verwendet. Die Blots wurden dann mit polyklonalem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-H&L (HRP)-vorabsorbiertem Sekundärantikörper (Abcam, ab97080, 1:10.000) sondiert.

Subzelluläre Fraktionen wurden aus Gruppen von fünf 10–15 Wochen alten und 30–50 Wochen alten wt- und cTnI-G203S-Herzen, einem NE-PERTM Nuclear and Cytoplasmic Extraction Kit (ThermoFisher Scientific, 78833), ergänzt mit cOmplete™, hergestellt , Mini, EDTA-freie Protease- (Roche, 4693159001) und PhosStopTM-Phosphatase-Inhibitortabletten (Roche, 4906837001), gemäß Herstellerprotokollen. Die Blots wurden mit den folgenden primären Antikörpern untersucht: Gesamt-mTOR, mTOR (7C10) Kaninchen-mAb (Cell Signaling Technology, 2983, 1:1000); Aktives mTOR, Phospho-mTOR (Ser2448) (D9C2) XP® Rabbit mAb (Cell Signaling Technology, 5536, 1:1000); Gesamtes SRP6, S6-ribosomales Protein (5G10) Kaninchen-mAb (Cell Signaling Technology, 2217, 1:1000); Aktives SRP6, ribosomales Phospho-S6-Protein (Ser235/236) (2F9) Kaninchen-mAb (Cell Signaling Technology, 4856, 1:1000). Die folgenden Primärantikörper wurden für die Ladekontrollen verwendet: β-Tubulin-Antikörper (Cell Signaling Technology, 2146, 1:500); Histon H2B (D2H6) Kaninchen-mAb (Cell Signaling Technology, 12364, 1:1000). Die Blots wurden mit voradsorbiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-H&L (HRP)-Sekundärantikörper (Abcam, ab97080, 1:10.000) sondiert. Dieselben Antikörper wurden verwendet, um die Reinheit der Zytoplasma- und Kernfraktionen zu bestätigen (ergänzende Abbildung 5).

Spezies: H, M, R; Anwendungen: WB, ICC, IF, IFC, IHC, IP; Validiert von Alomone. Zitat: 124 (https://www.alomone.com/p/anti-cav1-2-antibody/ACC-003). Monoklonales Kaninchen-Anti-β1-Integrin (D6S1W, Cell Signaling Technology, 34971): Spezies: H, M, R; Anwendungen: WB, IHC; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 31 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/integrin-b1-d6s1w-rabbit-mab/34971). Monoklonaler Kaninchen-Anti-GAPDH (Cell Signaling Technology, 2118): Spezies: H, M, R, Mk, B, Pg; Anwendungen: WB, IHC, IF, F; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 5360 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/gapdh-14c10-rabbit-mab/2118). Gesamt-mTOR (mTOR) (7C10, Kaninchen-mAb, Cell Signaling Technology, 2983): Spezies: H, M, R, Mk; Anwendungen: WB, IP, IHC, IF, F; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 1837 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/mtor-7c10-rabbit-mab/2983). Aktives mTOR (Phospho-mTOR) (Ser2448, D9C2, XP® Rabbit mAb, Cell Signaling Technology, 5536): Spezies: H, M, R, Mk; Anwendungen: WB, IP, IF; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 1356 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-mtor-ser2448-d9c2-xp-rabbit-mab/5536). Gesamt-SRP6 (ribosomales S6-Protein, 5G10, Kaninchen-mAb, Cell Signaling Technology, 2217): Spezies: H, M, R, Mk; Anwendungen: WB, IHC, IF; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 1610 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/s6-ribosomal-protein-5g10-rabbit-mab/2217). Aktives SRP6 (Phospho-S6-ribosomales Protein, Ser235/236, 2F9, Kaninchen-mAb, Cell Signaling Technology, 4856): Spezies: H, M, R, Mk; Anwendungen: WB, IF, F; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 255 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/phospho-s6-ribosomal-protein-ser235-236-2f9-rabbit-mab/4856). β-Tubulin-Antikörper (Cell Signaling Technology, 2146): Spezies: H, M, R, Mk, Z, B; Anwendungen: WB, IHC, IF, F; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 676 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/b-tubulin-antibody/2146). Histon H2B (D2H6, Kaninchen-mAb, Cell Signaling Technology, 12364): Spezies: H, M, R, Mk; Anwendungen: WB, IHC, ChiP; Validiert durch Cell Signaling Technology. Zitat: 33 (https://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/histone-h2b-d2h6-rabbit-mab/12364).

Die Ergebnisse werden als Mittelwert ± SEM angegeben. Für nichtparametrische Daten wurde die statistische Signifikanz bei P < 0,05 unter Verwendung des Mann-Whitney-Tests (zweiseitig) oder des Kruskal-Wallis-Tests (einseitig) für Mehrfachvergleiche akzeptiert. Für parametrische Daten wurde die statistische Signifikanz bei P < 0,05 unter Verwendung eines Brown-Forsythe- und Welch-ANOVA-Tests (einseitig) (GraphPad Prism Version 9.1.2) akzeptiert. Anzahl der Wiederholungen und statistische Vergleiche werden in Zahlen angegeben.

Die Software „Power and Sample Size“ (PS) wurde verwendet, um die Probengröße unter Berücksichtigung der Variabilität zwischen den Tieren und der Variabilität zwischen den Tieren zu bestimmen. Damit wurde festgestellt, dass die Reaktionen an 10 Mäusen jedes Mausstamms/Genotyps untersucht werden müssten, um die Nullhypothese abzulehnen, dass die Populationsmittelwerte der Versuchsgruppen mit einer Wahrscheinlichkeit/Potenz von 0,95 gleich sind (Fehlerwahrscheinlichkeit Typ I =). 0,05). Bemerkenswert ist, dass die aus allen In-vitro-Daten resultierenden p-Werte zwischen p < 0,0001 und p < 0,0216 lagen, was darauf hindeutet, dass die verwendeten Stichprobengrößen ausreichten, um das festgelegte Signifikanzniveau zu überschreiten.

Es wurden keine Daten aus lebenden Zellen ausgeschlossen. Alle Replikationsversuche in lebenden Zellen waren erfolgreich. Für In-vitro-Studien wurden Experimente mit unterschiedlichen Agonisten/Antagonisten an verschiedenen Versuchstagen nach dem Zufallsprinzip durchgeführt. Darüber hinaus führten zwei Personen gleichzeitig Experimente mit zwei unterschiedlichen Fluoreszenz-Versuchsaufbauten durch. Eine Person war in die Anwendung der Agonisten/Antagonisten eingeweiht, um sicherzustellen, dass die richtigen Wirkstoffe in der richtigen Reihenfolge angewendet wurden. Die andere Person war geblendet. Die Daten wurden in allen Fällen zuverlässig zwischen Einzelpersonen repliziert.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Alle während dieser Studie generierten oder analysierten Daten sind in diesem veröffentlichten Artikel (und der Datei mit ergänzenden Informationen) enthalten. Quelldaten können in der Supplementary Data-Datei abgerufen werden.

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Wir danken Frau Sarah Wong für die technische Unterstützung bei der Erfassung und Verarbeitung der mTOR-Immunoblot-Daten. Projektzuschuss des National Health and Medical Research Council of Australia APP1143203 (HMV). Projektzuschuss des National Health and Medical Research Council of Australia APP1098449 (YSC). Senior Research Fellowship des National Health and Medical Research Council of Australia APP1117366 (LCH). Heart Foundation of Australia Future Leader Fellowship 101930 (HMV). Heart Foundation Australia Future Leader Fellowship 101173 (YSC). Stipendium des Australian Government Research Training Program (ILC). National Health and Medical Research Council of Australia Investigator Grant APP1173015 (DS).

School of Human Sciences, The University of Western Australia, Crawley, WA, Australien

Helena M. Viola, Caitlyn Richworth, Tanya Solomon, Ian L. Chin, Henrietta Cserne Szappanos, Yu Suk Choi und Livia C. Hool

Die Australian National University, Canberra, ACT, Australien

Srinivasan Sundararaj, Dmitry Shishmarev und Marco G. Casarotto

Victor Chang Cardiac Research Institute, Sydney, NSW, Australien

Livia C. Hool

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Konzeptualisierung: HMV, LH Datenkuration: HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Formale Analyse: HMV, ILC, YSC, HCS, SS, DS Untersuchung: HMV, CR, TS, ILC, HCS, SS, DS Methodik: HMV, YSC Projektverwaltung: HMV Überwachung: HMV, YSC, HCS, MC, LH Validierung: HMV, YSC, MC Visualisierung: HMV-Schreiben – Originalentwurfsvorbereitung: HMV-Schreiben – Überprüfung und Bearbeitung: HMV, CR, TS, ILC , YSC, HCS, SS, DS, MC, LH

Korrespondenz mit Helena M. Viola oder Livia C. Hool.

MC, SS, DS und LH sind Erfinder mit angemeldetem Patent (australische Anmeldenummer 2021900252). Alle anderen Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Communications Biology dankt den anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Hauptredakteure: Nicholas Kurniawan und Christina Karlsson Rosenthal.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Viola, HM, Richworth, C., Solomon, T. et al. Ein maladaptiver Rückkopplungsmechanismus zwischen der extrazellulären Matrix und dem Zytoskelett trägt zur Pathophysiologie der hypertrophen Kardiomyopathie bei. Commun Biol 6, 4 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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Eingegangen: 22. Februar 2022

Angenommen: 17. November 2022

Veröffentlicht: 3. Januar 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04278-9

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